Prawidłowa kolejność w metodzie Kjeldahla to właśnie: mineralizacja „na mokro”, potem destylacja, a na końcu miareczkowanie. Cały sens tej metody polega na tym, żeby w pierwszym etapie zamienić azot organiczny z białek na jon amonowy. Robi się to przez mineralizację na mokro, czyli ogrzewanie próbki mięsa z stężonym kwasem siarkowym(VI), najczęściej z dodatkiem katalizatorów (np. siarczan potasu, siarczan miedzi). Ten etap musi być prowadzony aż do uzyskania klarownego, bezbarwnego lub lekko zielonkawego roztworu – wtedy mamy pewność, że cała materia organiczna została rozłożona. Dopiero po takiej mineralizacji można przejść do destylacji. W praktyce do zmineralizowanej próbki dodaje się mocną zasadę (zwykle NaOH), aby uwolnić amoniak z jonów amonowych. Następnie amoniak jest odparowywany w aparacie destylacyjnym i pochłaniany w roztworze odbierającym, np. w kwasie borowym lub innym znanym objętościowo roztworze. To właśnie etap destylacji jest kluczowy dla ilościowego przechwycenia amoniaku – w laboratoriach kontroli jakości stosuje się do tego specjalne destylarki Kjeldahla, zgodne z normami PN-EN czy ISO, żeby zminimalizować straty. Na końcu jest miareczkowanie, czyli oznaczenie ilości pochłoniętego amoniaku metodą objętościową. Najczęściej miareczkuje się roztworem HCl lub H2SO4 o znanym stężeniu, z użyciem wskaźnika barwnego lub detekcji potencjometrycznej. Z objętości zużytego titranta oblicza się zawartość azotu, a następnie przelicza się ją na białko, stosując odpowiedni współczynnik (dla mięsa zwykle 6,25). W zakładach mięsnych ta metoda jest standardem referencyjnym do weryfikacji jakości surowca i kontroli zgodności z deklaracją na etykiecie, bo daje powtarzalne, porównywalne z normami wyniki, jeśli tylko trzymamy się właśnie tej kolejności etapów.
W metodzie Kjeldahla kolejność etapów nie jest przypadkowa, tylko wynika z samej chemii procesu. Najpierw musi dojść do pełnego rozkładu związków organicznych i związania azotu w formie jonów amonowych – temu służy mineralizacja na mokro w stężonym kwasie siarkowym. Pomysły typu „najpierw miareczkowanie, potem destylacja” odwracają logikę analizy: nie da się oznaczyć ilości azotu objętościowo, jeśli wcześniej nie zostanie on uwolniony w formie amoniaku i przeniesiony do roztworu, który można miareczkować. To jest właśnie typowy błąd myślowy: traktowanie tych etapów jak niezależnych operacji, które można dowolnie przestawiać, zamiast widzieć je jako ściśle powiązane ogniwa jednego procesu. Kolejne nieporozumienie dotyczy samego rodzaju mineralizacji. W klasycznej metodzie Kjeldahla stosuje się mineralizację na mokro, czyli z udziałem ciekłego kwasu siarkowego, a nie „na sucho” (spalanie w wysokiej temperaturze bez udziału ciekłego kwasu). Mineralizacja na sucho jest używana w innych metodach oznaczania pierwiastków, ale dla azotu białkowego w mięsie nie jest to standardowa procedura referencyjna, bo może prowadzić do strat azotu lotnego i gorszej powtarzalności wyników. Z mojego doświadczenia w laboratorium właśnie to mylenie różnych technik mineralizacji często prowadzi do błędnych skojarzeń. Jeżeli ktoś widział piec do mineralizacji na sucho przy analizie popiołu, to odruchowo przenosi ten obraz na każdą analizę. W dobrej praktyce analitycznej trzymamy się jednak tego, co opisują normy: dla białka metodą Kjeldahla – mokra mineralizacja, potem destylacja amoniaku w środowisku zasadowym, a na końcu miareczkowanie roztworu absorbującego. Dopiero taka sekwencja gwarantuje, że cały azot został przekształcony, ilościowo przeniesiony i precyzyjnie oznaczony. Wszystkie warianty z odwróconą kolejnością lub z mineralizacją na sucho po prostu łamią tę logikę procesu i nie spełniają wymagań metody referencyjnej stosowanej w kontroli jakości żywności.